Génétique, recherche et

thérapie génique des

Epidermolyses bulleuses

Centre de Toulouse - Professeur Alain Hovnanian

(Service de Génétique médicale et Inserm U563, CHU Purpan)

I - Service hospitalier de Génétique médicale
  1. Consultation
  2. Laboratoire hospitalier
    2.1 Aspects réglementaires
    2. 2 Diagnostic moléculaire
    2.3 Diagnostic prénatal
II - Laboratoire de recherche
  1. Composition de l'équipe
            Matthias TITEUX, post-doctorant, bourse de l'Association Française contre les Myopathies
            José MEJIA, chargé de recherche de classe 1, Inserm
            Luciné MEJLUMIAN, post-doctorante, CDD DEBRA
            Laure TONASSO, technicienne, CDD EBAE
            Audrey DECHA, assistante-ingénieur, CDD DEBRA
            Sandra MIRVAL, technicienne universitaire, Université Paul Sabtier
  2. Sujets de recherche
    2.1 Approches thérapeutiques
    2.2 Etude des conséquences des mutations
    2. 3. Recherche de gènes modificateurs
III - Centre de ressource biologique
  1. Conservation des échantillons
  2. Base de données des mutations
IV - Perspectives

Le centre de Toulouse associe une activité clinique, de diagnostic moléculaire, de conseil génétique et de diagnostic prénatal des épidermolyses bulleuses (EB) héréditaires (service de Génétique Médicale), à une activité de recherche (Inserm U563) centrée sur la thérapie génique des EB dystrophiques (EBD) et les mécanismes sous-tendant la sévérité de ces maladies.

I - Service hospitalier de Génétique médicale

1. Consultation

Les consultations du Pr Alain Hovnanian ont lieu tous les vendredis matin de 8h30 à 12h30 dans le service de Génétique du Pr Patrick Calvas à l’hôpital Purpan à Toulouse, au rez-de- chaussée du pavillon Lefebvre (Tél : 05 61 77 90 79). Chaque consultation dure en moyenne 1 heure par famille. Elle a pour objectif principal le conseil génétique des couples ayant un enfant atteint, ou dont l’un des membres est atteint d’EB. Elle s’inscrit souvent dans le contexte d’un projet parental, pour lequel le couple sollicite un avis sur le pronostic et les possibilités de traitement de la maladie, le risque de récidive lors d’une grossesse à venir, la sévérité de la maladie si le futur enfant était atteint. L’objectif de la consultation est de répondre au mieux à ces questions, ce qui nécessite de confirmer la forme d’EB en cause, de faire le point sur la maladie et compléter le bilan si nécessaire. Le questionnaire médical du réseau national d’étude des EB (Inserm-AFM) est rempli, et une biopsie cutanée est proposée pour préciser la forme d’EB si nécessaire. L’étude génétique nécessite une autorisation signée des parents si le patient est mineur, avant de réaliser un prélèvement sanguin de quelques millilitres à chaque membre de la famille. Ces consultations se font en collaboration avec celles de dermatologie pédiatrique du Dr Juliette Mazereeuw à l’hôpital des Enfants, les mardis et jeudis après-midi (Tél : 05 34 55 85 48).

2. Laboratoire hospitalier

2.1 Aspects réglementaires

Le laboratoire est habilité par le Ministère de la Santé pour la réalisation de diagnostics génétiques et prénataux, condition légale indispensable pour la pratique de cette activité médicale. Le diagnostic moléculaire des EB héréditaires y est développé depuis 2000, initiallement dans le contexte d'une activité nouvelle. Celle-ci vient d'être reconduite et donc pérennisée par la direction des hôpitaux de Toulouse.

2. 2 Diagnostic moléculaire

Les prélèvements sanguins de chaque patient et de sa famille sont acheminés au laboratoire hospitalier de Génétique pour extraction de l'ADN (acide désoxyribonucléique) et diagnostic moléculaire d'EB. De nombreuses demandes nous parviennent également de différents hôpitaux de France, en particulier du Pr Christine Bodemer du service de Dermatologie de l'hôpital Necker Enfants malades à Paris. L'activité de diagnostic moléculaire des EB est assurée en grande partie par Anne-Marie Mazarguil, technicienne hospitalière dédiée aux génodermatoses, sous la direction du Pr Hovnanian. En fonction de la forme d'EB en cause, les mutations des gènes des kératines 5 et 14 (KRT5 et KRT14) (EB simples) ou du collagène VII (COL7A1) (EB dystrophique dominante et récessive (EBDD et EBDR) sont recherchées. En cas d'EB jonctionnelle, les prélèvements sont adressés au laboratoire de Nice. La recherche de mutations est de difficulté variable, en fonction du nombre et de la taille du/des gène(s) en cause et de la nature de l'anomalie responsable de la maladie. Elle utilise l'amplification d'ADN par PCR (polymerase chain reaction) associée à des techniques très sensibles de détection de mutation (Denaturing High Performance Liquid Chromatography) et in fine le séquençage de la partie du gène portant la mutation (Fig. 1). La présence ou l'absence de la/les mutations identifiée(s) chez l'enfant atteint est vérifiée chez les parents, afin de confirmer leur caractère récessif ou dominant. L'identification de la /des mutation(s) responsable(s) de la maladie dans une famille est importante pour plusieurs raisons : elle apporte la confirmation moléculaire de la forme d'EB dont l'enfant est atteint, elle permet de comparer la clinique avec celle d'autres patients porteurs de la même mutation, de prédire la conséquence de la mutation sur la protéine codée par le gène, et surtout elle rend possible un conseil génétique et un diagnostic prénatal au cours d'une prochaine grossesse. Le résultat de l'analyse moléculaire ainsi que son interprétation sont adressés par le service de Génétique au médecin prescripteur, qui le communique à son patient. Le Tableau I indique le nombre de diagnostics moléculaires d'EB réalisés dans le service de 2000 à 2004

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L'enfant a hérité d'une mutation maternelle (3832-3C>G) qui prédit une anomalie de " découpage " de l'ARNm de COL7A1 ; et d'une mutation paternelle (R226X) changeant l'acide aminé arginine (R) en position 226, en un codon stop prématuré (X). Chaque lettre (A, T, C et G) représente une des lettres du code génétique qui compose cette région de COL7A1, dont chaque triplet code pour un acide aminé. Dans cet exemple, le triplet CGA code pour une arginine, alors que le triplet TGA détermine un arrêt de la fabrication de la protéine.

 2.3 Diagnostic prénatal

Il vise à déterminer précocemment le statut sain ou atteint du fetus, afin de poursuivre ou non la grossesse. C'est un des aspects essentiels mais aussi les plus difficiles de l'activité de conseil génétique. Il ne peut être réalisé que dans des laboratoires de Génétique habilités par le Ministère de la Santé. Il est réservé aux formes sévères d'EB. Il ne peut être proposé qu'en cas de certitude absolue de forme d'EB, au mieux apportée par l'identification de la mutation causale chez l'enfant atteint (analyse directe). Mais il peut également être envisagé sans que la mutation causale ait été identifiée, si le diagnostic de forme et de mode de transmission d'EB sont certains. Il repose alors sur l'utilisation de marqueurs génétiques situés à proximité immédiate du gène impliqué (analyse indirecte). Cette approche nécessite une étude familiale préalable.

Les aspects éthiques et médicaux de chaque cas sont discutés avant toute décision, avec le Centre pluridisciplinaire de diagnostic prénatal. Celui-ci se réunit de façon hebdomadaire sous la direction du Dr Marie-France Saramon, obstétricienne et spécialiste d'échographie fœtale, à l'hôpital Paule de Viguier (maternité). Le Tableau II indique le nombre et le résultat des 22 diagnostics prénataux réalisés depuis 2000 pour le risque d'EBDR à Toulouse. Ceci a permis la naissance de 17 fœtus sains depuis 2000.

 Le diagnostic prénatal est réalisé après information éclairée et consentement écrit de la mère. Il peut être pratiqué selon deux modalités, en fonction  du terme de la grossesse :

a) A 12 semaines d'aménorrhée (SA) (correspondant à 10 semaines de grossesse), une biopsie de villosités choriales est proposée. Il s'agit d'un geste réalisé en ambulatoire, ne nécessitant pas d'hospitalisation. Le prélèvement est ensuite rapidement " trié " sous loupe binoculaire afin de séparer le tissu fœtal du tissu maternel. L'ADN est extrait d'une partie de ce  prélèvement pour le diagnostic moléculaire. L'autre partie est mise en culture pour un caryotype (analyse du nombre et de la forme des chromosomes) de sécurité. Ce dernier a pour objectif d'éliminer de principe une anomalie chromosomique éventuelle détectable lorsque le diagnostic moléculaire prédit un fœtus non atteint.

b) A 16 SA (soit 14 semaines de grossesse), un prélèvement de liquide amniotique (amniocenthèse) est réalisé. Une partie des cellules du liquide amniotique sont étudiées immédiatement pour analyse moléculaire, l'autre est mise en culture pendant 2 à 3 semaines pour confirmation du diagnostic moléculaire et pour caryotype de sécurité.

Dans les deux cas, l'analyse cytogénétique se fait sous la responsabilité des Dr Georges Bourrouillou et Marie-Claire Vincent, praticiens hospitaliers habilités en cytogénétique.

Note sur le diagnostic pré-implantatoire : Il n'est pratiqué que dans 3 centres en France (Paris, Strasbourg et Montpellier). Il n'a encore jamais été pratiqué pour le risque d'EB. Les délais d'attente sont de 1 à 2 ans environ. L'indication est discutée cas par cas, en particulier en cas d'antécédents de plusieurs interruptions médicales de grossesse. 

II - Laboratoire de recherche

Ce jeune département de Génétique Fonctionnelle fait partie du Centre de recherche de l'Inserm (unité U563) récemment créé à Toulouse-Purpan en 2002. Le département, dirigé par le Pr Hovnanian, est situé au 3ème étage du pavillon Lefebvre, Hôpital Purpan (tél : 05 62 74 45 00, e-mail : Cette adresse email est protégée contre les robots des spammeurs, vous devez activer Javascript pour la voir. ).

Il comprend 32 personnes réparties en 4 équipes, dont une équipe travaille exclusivement sur les épidermolyses bulleuses.

1. Composition de l'équipe

Cette équipe comprend 6 personnes : 1 chercheur statutaire, 2 chercheurs post-doctorants, 1 assistant-ingénieur et 2 techniciennes. Parmi ces personnes, 4 sont financées par l'EBAE (1), DEBRA (2) ou l'AFM (1).

• Matthias TITEUX, post-doctorant, bourse de l'Association Française contre les Myopathies
• José MEJIA, chargé de recherche de classe 1, Inserm
• Luciné MEJLUMIAN, post-doctorante, CDD DEBRA
• Laure TONASSO, technicienne, CDD EBAE
• Audrey DECHA, assistante-ingénieur, CDD DEBRA
• Sandra MIRVAL, technicienne universitaire, Université Paul Sabtier

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2. Sujets de recherche

La recherche est centrée sur le développement d'approches thérapeutiques des EBD, une meilleure compréhension des conséquences des mutations de COL7A1, et la recherche de gènes modifiant la sévérité de la maladie. 

2.1 Approches thérapeutiques

La thérapie génique ex vivo par greffe de cellules de l'épiderme et du derme génétiquement corrigées est une des principales voies actuellement poursuivies. Le Pr Hovnanian est le coordinateur d'un projet européen visant à mener à bien toutes les phases pré-cliniques de ce projet, pour conduire à terme à un essai clinique pilote (Figure 2). Ce projet implique 5 autres équipes internationales (France, Suisse, Grande Bretagne et Allemagne), dont Généthon à Evry (Dr Olivier Danos) pour la production de virus sécurisés transportant l'ADNc de COL7A1. Le projet débutera en 2005 et durera 3 ans. Il comporte 3 phases : 1. la mise au point de peaux reconstruites génétiquement corrigées à l'aide de vecteurs rétroviraux et lentiviraux sécurisés et la démonstration du caractère fonctionnel de la correction in vivo chez la souris ; 2. la production de lots viraux pour application clinique chez l'homme et le respect des aspects réglementaires relatifs à la thérapie génique chez l'homme, en particulier auprès de l'AFSSAPS ; 3. une première étude pilote sur un nombre limité (6) de patients EBDR visant à déterminer l'efficacité et la tolérance des greffes corrigées. Les résultats actuels sont encourageants puisque cette équipe a récemment montré chez la souris le caractère fonctionnel de greffons de peaux reconstruites obtenues avec des fibroblastes de patient génétiquement corrigés à l'aide de vecteurs sécurisés (Figure 3).

Aspect microscopique (A, C et E) et immunodétection de collagène VII (B, D et F) dans différents greffons de peaux reconstruites. A et B : Kératinocytes et fibroblastes normaux ; C et D : kératinocytes et fibroblastes non corrigés d'un patient EBDR. Notez le décollement cutané entre l'épiderme et le derme indiqué par une flèche, et l'absence de détection de collagène VII (D) ; E et F : kératinocytes EBDR non corrigés et fibroblastes EBDR corrigés avec un vecteur sécurisé exprimant COL7A1, montrant l'absence de décollement cutané et la détection de collagène VII nouvellement synthétisé par les fibroblastes corrigés.

D'autres approches récemment proposées par d'autres équipes  (injection de collagène VII recombinant, greffe de fibroblastes de sujet HLA compatible non EBDR) pourraient également être envisagées en fonction des progrès qui seront réalisés dans ces domaines.

2.2 Etude des conséquences des mutations

Dans un nombre non négligeable de cas, la nature causale ou non de la mutation identifiée n'est pas certain, parce qu'elle ne conduit pas à une interruption de la protéine. Il est alors nécessaire de rechercher d'autres mutations sur la totalité du gène, et/ou d'étudier les conséquences fonctionnelles de cette mutation sur la protéine. Ceci nécessite souvent de cultiver les kératinocytes et/ou les fibroblastes des patients, ce qui est réalisé à partir d'une biopsie cutanée de 4 mm de diamètre obtenue après consentement signé des parents.  

2. 3. Recherche de gènes modificateurs

Plusieurs gènes impliqués dans la stabilité et le renouvellement de la zone de jonction entre l'épiderme et le derme pourraient jouer un rôle dans la sévérité d'expression de la maladie, pour une même mutation de COL7A1. L'objectif de cette recherche est d'identifier certains de ces gènes, en combinant des approches génétiques et fonctionnelles. 

III - Centre de ressource biologique

Le laboratoire de Génétique médicale et le département de l'unité Inserm U563 contribuent à la constitution d'un Centre de ressource biologique national des EB simples et des EB dystrophiques (dominantes ou récessives). Ils participent également à l'élaboration d'une base nationale de données des mutations identifiées chez ces patients, ainsi que les corrélations génotype-phénotype avec le Pr Christine Bodemer à l'hôpital Necker-Enfants malades à Paris.

1. Conservation des échantillons

L'ADN extrait des prélèvements sanguins, les biopsies cutanées, les kératinocytes et les fibroblastes cultivés à partir de ces biopsies sont conservés dans des conditions appropriées  de sécurité dans le laboratoire de Génétique Médicale ou à l'unité Inserm U563.

2. Base de données des mutations

Les informations sur la nature, la localisation et les conséquences des mutations identifiées sont conservées dans un fichier anonyme d'accès limité permettant une exploitation sécurisée des données.  

IV - Perspectives

Les perspectives d'évolution du Centre de Toulouse tendent vers un diagnostic moléculaire plus rapide et une amélioration du conseil génétique des couples à risque ; une meilleure compréhension des facteurs déterminant la sévérité d'expression de la maladie ; et la mise en place d'un premier essai pilote de thérapie génique au terme du projet européen. La mise en place d'un laboratoire de Biothérapie et le recrutement du personnel hospitalier qualifié dédié à cette nouvelle activité à l'hôpital des Enfants de Toulouse sont en cours.