RAPPORT SUR

L’ACTIVITE DE L'UNITE INSERM 634

ET

DU CENTRE DE REFERENCE

DES EPIDERMOLYSES BULLEUSES

DU CHU DE NICE

L’année a été marquée par l’obtention en mai 2007 du label Centre de Référence Maladies Rares pour les EBH (responsable Pr JP Lacour). L’organisation du Centre de Référence des EBH de Nice se fait donc maintenant autour d’une collaboration officialisée entre le service de Dermatologie du CHU de Nice et l’Unité INSERM 634 : - le service de Dermatologie va intensifier son activité de prise en charge clinique, thérapeutique et éducationnelle.

Dans ce but, un médecin, une infirmière et une secrétaire vont être recrutés de façon imminente grâce au financement obtenu pour le Centre de Référence ;

- le laboratoire poursuit quant à lui son activité diagnostique (immunohistologique et moléculaire) et son activité de recherche physiopathologique et thérapeutique, plus que jamais indispensable.

La subvention de l’EBAE est exclusivement dévolue à l’activité de laboratoire : elle est utilisée au financement du salaire d’un ingénieur (Alexandra Charlesworth) et à l’achat de consommables nécessaires à l’activité diagnostique dont le coût ne peut être assuré par l’Unité INSERM elle-même.

Alexandra Charlesworth assure l’activité d’identification des mutations chez les patients et leur famille ainsi que les diagnostics moléculaires anténatals. Depuis quelques mois, elle a également dû prendre en charge l’activité diagnostique immunohistologique des EBH suite au départ de la technicienne qui assurait jusqu’à présent cette activité. Ce surcroit de travail a eu un retentissement sur l’activité diagnostique, augmentant sensiblement les délais de réponse du diagnostic immunohistologique et moléculaire. Le recrutement d’un technicien dévolu à l’activité immunohistologique est hautement souhaitable mais ne peut pas être envisagé actuellement, faute de moyens.

Activité diagnostique du laboratoire

Les demandes pour diagnostic immunohistologique et/ou moléculaire sont régulières. Une tendance nette à l’augmentation a été constatée depuis janvier 2007. Entre janvier et août 2007, nous avons ainsi reçu des prélèvements cutanés et ou sanguins de 33 familles (soit 50 prélèvements). Dix familles sont originaire de France, 3 de Tunisie, 2 des Pays Bas, 2 de Suisse, 2 d’Espagne, 1 d’Afrique du Sud, 1 de Belgique, 1 du Maroc. Suite à des contacts récents avec des médecins en charge de nouveaux patients atteints d’EBH, des prélèvements de 10 autres patients sont attendus dans les jours ou semaines à venir.

En l’absence d’antécédents familiaux d’EBH ou de diagnostic déjà documenté dans la famille nous réalisons une première étape de diagnostic immunohistochimique (immunolocalisation) qui permet de déterminer le niveau de clivage dans la membrane basale et de déceler l’expression anormale des composants de la jonction dermoépidermique liée à une possible altération de l’expression du gène correspondant.

Grâce à un délai rendu diagnostique habituellement très rapide, nous sommes à même de fournir très vite en période néonatale des éléments pronostiques à court ou long terme des nouveau-nés, notamment pour ceux atteints de certaines formes graves (EB jonctionnelles léthales, EB avec atrésie pylorique, EB dystrophiques récessives). Cette activité est un élément indispensable à l'annonce du diagnostic par l'équipe médicale en charge du patient en période néonatale.

Diagnostic moléculaire post-natal

Une fois le gène "candidat" identifié, et lorsqu’il existe des arguments médicaux justifiant cette analyse, l’identification des mutations est réalisée chez les patients et leur famille. Nous avons pu identifier, sur la totalité des malades ainsi étudiés, la protéine impliquée dans la maladie et le gène candidat correspondant. Cette étude est réalisée dans notre laboratoire par Alexandra Charlesworth pour toutes les formes d’EBH (EBJ, AP-EBJ, GABEB, MD-EBS, T. KINDLER, EBD). Seule l'analyse génétique des malades souffrant d’EBS est confiée à un laboratoire partenaire écossais (B. Lane, Dundee). En ce qui concerne les EBJ, une synthèse de l’activité diagnostique de ces dernières années a été effectuée à l’occasion d’un travail de thèse (publication en cours).

Le laboratoire Inserm U634 en collaboration avec le service de Dermatologie du CHU de Nice a pris en charge 341 patients atteints d'épidermolyse bulleuse entre 1996 et 2006, ce qui correspond à 297 familles. Parmi ces patients, 109 cas d'EBJ ont donné lieu à une analyse moléculaire. Elle a permis d’identifier 206 allèles mutés dont 62 mutations jamais décrites dans la littérature. Huit mutations récurrentes ont été retrouvées dans cette série. Il s’agit de la plus grande série française d'EBJ jamais décrite. Nos données ont permis de définir des corrélations phénotypes-génotypes : gravité du phénotype en cas d'association à des mutations de type codon stop prématuré sur les 2 allèles et phénotype modéré en cas d'association à au moins une mutation de type faux sens ou mutation du site d'épissage. Nos données ont également permis de montrer la spécificité géographique de certaines mutations récurrentes associées aux EBJ et de définir de nouvelles mutations associées à des phénotypes inhabituels élargissant l'hétérogénéité des EBJ. Ceci permet de diriger la recherche du gène candidat dans certains sous groupes de malades, ce qui permet alors d’identifier les mutations dans des délais très courts, et également de suggérer de nouvelles stratégies diagnostiques.

De janvier à août 2007, les mutations ont été identifiées chez 12 familles. Six sont de nouvelles mutations non encore publiées.

(cliquer sur l'image pour agrandir) 

Diagnostic anténatal

Grâce à l’étude de DNA génomique isolée à partir de villosités choriales, nous avons aussi génotypé 8 foetus dans le cas de grossesses à risque. Les échantillons biologiques nous ont été envoyés par des centres qui avaient en charge d’effectuer le diagnostic anténatal d'EBJ mais qui n’étaient pas en mesure de l’assurer techniquement.

Thérapie génique des EBJ

L'ensemble de nos expériences a montré que la modification des kératinocytes EBJ par des vecteurs rétroviraux recombinants exprimant les chaînes de la laminine-5 permet d’obtenir in vitro des feuillets épidermiques ayant des caractéristiques proches de la normale. Notre objectif est d'évaluer, dans le cadre d’un essai clinique de phase I/II, les effets d’une thérapie génique avec des feuillets épidermiques transduits ex vivo, chez des patients ayant une forme non léthale d'EBJ causée par des mutations sur le gène codant pour la chaine ß3 de la laminine 5. Ce projet multicentrique, réalisé dans le cadre du projet Franco-Italien AFM-Telethon Italia, est entré dans la phase d'expérimentation clinique ; un patient à été soumis à une série de greffes en Italie (M. DeLuca, Venise). Les résultats, très encourageants, de cet étude pilote ont été publiés par l’équipe italienne. Les examens cliniques et moléculaires effectués 20 mois après la transplantation montrent la persistance du greffon dans lequel l’expression du trangène curatif se maintient à un niveau thérapeutique. Les greffes de trois patients sont prévues à Nice. Ce projet est actuellement en cours d’évaluation par l’Afssaps. Le renfort de l’équipe médicale par l’obtention du label Centre de Référence et l’ouverture toute récente de l’Unité de Thérapie Cellulaire et Génique (UTCG) du CHU devrait enfin permettre la mise en place de ce projet dans un délai raisonnable.

Thérapie cellulaire des EBDR

Une approche par thérapie cellulaire des patients atteints d’EBDR paraît envisageable par l’établissement d’une collaboration avec une équipe Espagnole. Une peau artificielle chimérique à été récemment greffée chez un patient atteint d'EBDR présentant une syndactylie importante. Les fibroblastes, isolés à partir d'un donneur (frère sain), ont été ensemencés dans un gel de fibrine obtenue à partir du sang du patient pour former un derme artificiel sur lequel les kératinocytes du patient ont été ensemencés pour générer l'épiderme. La peau artificielle ainsi obtenue a été greffée par des interventions successives sur les doigts d’une main du patient. Six mois après la première greffe, la zone traitée maintient une épithélialisation complète, la syndactylie est corrigée avec restauration des fonctions motrices des doigts. Aucun effet indésirable n’a été observé. A ce stade, notre objectif est de rassembler une cohorte de patients EBDR, afin 5 d'évaluer, dans le cadre d’essais cliniques, les effets d’une thérapie cellulaire des patients EBD par greffe de peaux artificielles chimériques construites in vitro à partir de kératinocytes EBD autologues et de fibroblastes humains dérivés de donneurs sains histocompatibles. Qui pourrait permettre une restauration durable voire définitive d’un phénotype cutané histopathologique normal et à l’autorégénération du tissu greffé. Ce projet va donner lieu à la soumission d’un PHRC 2008

Activité de recherche

Les axes de recherche principaux du laboratoire sont les suivants :

• cicatrisation cutanée et progression tumorale chez les patients EBJ
• étude pré-clinique pour la mise en place d'un protocole de thérapie génique des EBD
• phénomènes de dérégulations d’expression génique prédisposant au développement précoce de carcinomes cutanés chez les patients atteints d’EBDR.

Conclusion

Le soutien de l'EBAE est d’une importance fondamentale pour l'activité diagnostique (immunohistologique et moléculaire) et la valorisation des résultats de la recherche fondamentale et thérapeutique de notre laboratoire. Le label Centre de Référence Maladies Rares pour les EBH a permis d’obtenir de nos tutelles un soutien qui va nous permettre de recruter du personnel pour la prise en charge clinique des patients. Ce financement ne peut par contre pas être utilisé à des fins de fonctionnement diagnostique ou de recherche : le support de l'EBAE est donc indispensable à la poursuite de ces activités qui sont elles-mêmes un des moteurs du Centre de Référence. Celui-ci est actuellement dans une phase de montée en puissance qui sera bénéfique pour les malades et leur famille (qui seront probablement de plus en plus nombreux à avoir recours à notre activité), mais repose sur un équilibre entre l'activité clinique et l'activité de laboratoire, qui est totalement dépendant du soutien financier de l'EBAE.

Nice le 3 septembre 2007

Pr JP Lacour Responsable du centre de référence EBH	Dr G Meneguzzi  INSERM U634