Rapport annuel d’activité Thérapie génique ex vivo des épidermolyses bulleuses dystrophiques récessives à l’aide de rétrovirus sécurisés
Pr Alain Hovnanian Directeur du Département de Génétique, unité INSERM U563 Pavillon Lefebvre CHU Purpan, BP 3028 31024 Toulouse cedex 03 FRANCE Personnel financé par l’EBAE et travaillant sur le projet : Laure TONASSO, Technicienne Géraldine ALBEROLA, Assistante-Ingénieur Personnel non financé par l’EBAE et travaillant sur le projet : Dr José MEJIA, Chargé de Recherche 1, INSERM Dr Matthias TITEUX, Post-doctorant, financé par le projet Européen THERAPEUSKIN jusqu au 30.9.07 et par l’INSERM (contrat jeune chercheur) depuis le 1.10.07 Dr Valérie PENDARIES, Post-doctorante, financée par l’AFM Audrey DECHA, Assisante-Ingénieur, financée par le projet Européen THERAPEUSKIN I - Introduction Les enfants et les adultes atteints d’épidermolyses bulleuses dystrophiques récessives (EBDR) souffrent d’une grande fragilité de la peau et des muqueuses responsable dès la naissance de décollements bulleux sévères. Dès 1993, nous avons montré que les EBDR étaient dues à des mutations du gène du collagène VII (COL7A1) codant pour les fibres d’ancrage qui constituent des structures essentielles pour l’adhérence de l’épiderme au derme sous-jacent. Les mutations de ce gène entraînent une absence de production de collagène VII dans les formes les plus sévères (forme de Hallopeau-Siemens) et la production d’un collagène VII qualitativement anormal dans les autres formes de la maladie (formes généralisées non mutilantes, inversée ou localisée). Les mains des enfants atteints d’EBDR sont particulièrement atteintes et sont le siège de fusions et de rétractions des doigts dans les formes les plus sévères. Toutes les zones du corps peuvent être le siège de bulles et de décollements cutanés, avec une prédiclection pour les zones de traumatisme et de frottement telles les poignets, coudes, chevilles , genoux, hanches. La maladie expose à des complications locales et systémiques sévères (infections, dénutrition, retard de croissance, handicap fonctionnel) et surtout à la survenue de cancers cutanés qui représentent la première cause de mortalité chez ces patients. Il n’existe actuellement pas de thérapie spécifique des EBDR, et les soins apportés aux patients sont uniquement palliatifs. Le récent succès obtenu par l’équipe du Pr Michele De Luca et Fulvio Mavillo à Modène en Italie a apporté la preuve de la faisabilité du traitement par thérapie génique d’une autre forme d’épidermolyse bulleuse par greffe d’épiderme génétiquement corrigé. Ce patient adulte est atteint d’une forme non létale d’épidermolyse bulleuse jonctionnelle due à des anomalies d’un gène codant pour une des 3 sous-unités de la laminine 5, Des cellules souches de l’épiderme de ce patient ont été cultivées à partir d’une biopsie de peau et ont été génétiquement corrigées à l’aide d’un rétrovirus classique apportant une copie saine du gène défectueux (LAMB3). Des épithéliums ont été préparés à partir de ces cellules corrigées et ont été greffés sur les deux cuisses du patient. Après plus d’un an, l’épithélium greffé montre une très bonnne adhérence au derme sous-jacent, exprime les 3 sous-unités de la laminine V et résiste aux traumatismes provoqués sans donner lieu à des décollements cutanés. Ce résultat est très encourageant et conforte notre choix thérapeutique qui vise à utiliser le même type d’approche pour traiter les patients atteints d’EBDR. Les différences sont : la nature sécurisée du vecteur que nous utilisons pour limiter le risque de développement de tumeurs dues à l’intégration du gène dans les chromosomes de la cellule ; le type de greffes cutanées employées (peau équivalente constituée d’un épithélium et de derme équivalent), et la nature du gène apporté, COL7A1 codant pour le collagène VII.
II - Objectifs : Le projet a pour objectifs d’apporter la preuve pré-clinique de la faisabilité de la thérapie génique ex vivo des EBDR et la préparation d’un essai clinique chez des patients. L’approche utilise des autogreffes de peau génétiquement corrigée à l’aide de rétrovirus sécurisés. Celles-ci sont obtenues en corrigeant génétiquement les cellules souches de l’épiderme et les fibroblastes en culture de patients à l’aide d’un vecteur rétroviral apportant une copie saine du collagène VII. Les cellules génétiquement corrigées sont ensuite utilisées pour former des peaux équivalentes dont le caractère fonctionnel (absence de décollement cutané, ré-expression de collagène VII et formation de fibres d’ancrage) est étudié par greffe cutanée chez la souris immuno-tolérante. La démonstration de la preuve de principe au cours des études précliniques chez l’animal permet de préparer un essai clinique chez les patients.
III - Résultats : Au cours des années précédentes (2005 et 2006), nous avons développé et testé plusieurs constructions virales transportant le collagène VII. Nous avons sélectionné les meilleures constructions permettant de corriger génétiquement avec une grande efficacité les cellules de la peau de ces patients en culture. Nous avons mis au point les systèmes de peau recontruite à partir de ces cellules génétiquement corrigées, que nous avons greffées chez la souris. Ces travaux nous ont permis de sélectionner la meilleure construction virale en termes d’efficacité, de sécurité et de reproductibilité. Cette année, nous avons finalisé les étapes pré-cliniques qui ont permis de démontrer la faisabilité de l’approche chez la souris. Ces différentes étapes sont exposées ci-dessous en détail. Afin de s’assurer de la sécurité de cette approche, nous avons montré que les cellules génétiquement corrigées n’entrainent pas de tumeur, et nous avons mis au point des tests in vitro permettant d’étudier la tolérance immunitaire vis à vis du collagène VII. Il nous reste à compléter ces études pré-cliniques par l’utilisation de ces tests chez les patients et des études de toxicologie chez la souris greffée. Ces résultats sont très importants car ils permettent de choisir le vecteur qui sera utilisé pour l’essai clinique et d’engager les étapes indispensables à la mise en place de cet essai.
A. Démonstration de la preuve de principe Ces études pré-cliniques ont visé à démontrer la faisabilité de la correction génétique in vivo chez la souris à l’aide d’un rétrovirus sécurisé utilisable en clinique. Elles ont compris les étapes suivantes : Afin de réduire le risque d’activation d’un oncogène situé à proximité du site d’intégration virale décrit avec les rétrovirus classiques, nous avons développé avec Généthon des rétrovirus sécurisés SIN (Self INactivating). Deux rétrovirus de ce type ont été construits, qui diffèrent par la nature du promoteur humain contrôlant l’expression de COL7A1. L’un contient le promoteur endogène du collagène VII qui ne s’exprime que dans les kératinocytes et les fibroblastes, l’autre comprend le promoteur ubiquitaire EF1alpha qui s’exprime dans tous les tissus humains. Des titres élevés de surnageants viraux de chacune des constructions ont pu être obtenus, mais la production de la construction avec le promoteur COL7A1 a due être abandonnée en raison de son manque de reproductibilité. Nous avons donc concentré nos efforts en 2007 sur l’utilisation du rétrovirus contenant le promoteur EF1a et celui-ci a donné d’excellents résultats au cours des expériences de transduction cellulaire.  Figure 1. Représentation schématique des 2 rétrovirus COL7A1 sécurisés développés. Ces 2 rétrovirus SIN (Self INactivating) diffèrent par la nature du promoteur humain contrôlant l’expression de COL7A1 : le promoteur endogène de COL7A1 (pCOL7A1) ou le promoteur EF1a (pEF1a).
2. Culture des cellules souches de l’épiderme L’épiderme est un tissu en perpétuel renouvellement qui se régénère entièrement toutes les 3 semaines. Ce renouvellement est assuré par les cellules souches de l’épiderme qui ne représentent qu’une sous-population minoritaire des kératinocytes. Il est donc essentiel de préserver ces cellules lors de la culture des cellules de l’épiderme afin d’assurer le succès de la greffe et la persistance de l’expression du transgène (gène apporté par le rétovirus, cad COL7A1). Nous avons donc cultivé les kératinocytes de patients et de sujets témoins selon la technique de référence utilisant une sous-couche nourricière de fibroblastes murins irradiés. La capacité de ces cellules à former des colonies de kératinocytes a été testée au cours de passages successifs. La figure 2 montre les résultats obtenus pour les cellules d’un de ces patients au 5ème passage. La proportion des colonies rondes et de grande taille, issues de cellules ayant un potentiel de prolifération élévé qui caractérise les cellules souches, a été comptée au microscope binoculaire. Celle-ci a été estimée entre 4 et 5% du nombre total des colonies, ce qui correspond aux valeurs attendues chez un adulte jeune et permet de s’assurer d’une proportion significative de cellules souches en culture.  Figure 2. Formation de colonies de kératinocytes à haut potentiel prolifératif. 500 kératinocytes ont été étalés sur une boite de 10 cm de diamètre et cultivés pendant 14 jours. Les cellules ont été fixées et colorées à la rhodamine B. Les colonies de grande taille et arrondies correspondent à des cellules à fort potentiel prolifératif.
3. Correction génétique des cellules de l’épiderme et du derme Nous avons cultivé les kératinocytes et fibroblastes primaires d’une jeune patiente atteinte de la forme la plus sévère d’EBDR (Hallopeau-Siemens) due à 2 mutations dans l’exon 2 de COL7A1. Cette patiente montre une absence complète d’expression de collagène VII à la jonction épidermique et de production de collagène VII detectable à partir de kératinocytes et fibroblastes en culture. Nous avons transduit (infecté) les cellules en culture de cette patiente à l’aide du rétrovirus SIN contenant COL7A1 sous le contrôle du promoteur EF1a (EF1A-COL7A1). Un taux élevé d’infection a été obtenu pour les deux types cellulaires, estimé par immunodétection à 60% pour les kératinocytes et 70 % les fibroblastes. Ce taux de transduction est suffisant pour envisager une application clinique. 4. Caractérisation du collagène VII recombinant Nous avons comparé les caractéristiques biochimiques du collagène VII produit par le rétrovirus à celles du collagène VII extrait de kératinocytes normaux. Le collagène VII néo-synthétisé est secrété dans le milieu de culture et présente un poids moléculaire (290 kDa) identique au collagène VII natif. Il forme des homotrimères de 900 kDa et génère des fragments protéolytiques de poids moléculaire attendu après digestion par la pepsine et la collagénase. Ces résultats montrent que les molécules de collagène VII recombinant sont secétées et forment des homotrimères indiscernables des molécules « natives » de collagène VII. Afin de démontrer le caractère fonctionnel de la correction génétique de ces cellules, celles-ci ont été utilisées dans un système de peau équivalente pouvant être greffé chez la souris immuno-tolérante. Ces greffes ont été laissées en place 3 à 5 mois, et leur analyse montre que la correction génétique permet de restaurer de façon durable une adhérence dermo-épidermique, une ré-expression du collagène VII le long de la jonction dermo-épidermique et la formation de fibres d’ancrage observables en microscopie électronique. Nous avons obtenu des résultats comparables lorsque seule une population cellulaire (kératinocytes ou fibroblastes) était corrigée. Figure 3. Correction génétique de peaux équivalentes greffées chez la souris. Aspect morphologique (A, C, E) et expression de collagène VII (B, D, F) dans les peaux équivalentes greffées. (A, B) Peau équivalente constituée de kératinocytes et de fibroblastes de sujet témoin ; (C, D) kératinocytes et fibroblastes EBDR non corrigés ; (E, F), kératinocytes et fibroblastes EBDR génétiquement corrigés à l’aide du rétrovirus sécurisé COL7A1. Le collagène VII est détecté le long de la jonction dermo-épidermique (B, F). Noter le clivage dermo-épidermique en D, et l’absence de clivage après correction génétique qui restaure l’expression de collagène VII le long de la jonction dermo-épidermique.
6. Etude du degré de différenciation des greffes génétiquement corrigées Il est également important de s’assurer de la qualité de l’épiderme formé à partir de kératinocytes génétiquement modifiés. Celui-ci montrait un aspect histologique et une expression des marqueurs de différenciation épidermique en tous points comparables au témoin. Ces études pré-cliniques démontrent que la restauration de la synthèse par les cellules des patients d’un collagène VII fonctionnel est réalisable et conduit à la correction prolongée du phénotype in vivo. Ils conduisent à évaluer les aspects sécuritaires de cette approche. B. Etude de la sécurité de l’approche 1. Absence de pouvoir tumorigène des cellules génétiquement corrigées La nature « SIN » (Self inactivating) des vecteurs sécurisés que nous avons utilisés réduit considérablement le risque d’activation d’un gène du cancer (« oncogène ») après intégration du rétrovirus dans un chromosome de la cellule hôte (mutagénèse insertionnelle). Cependant, nous avons tenu à vérifier que les cellules des patients EBDR génétiquement corrigées avec le rétovirus COL7A1, n’acquièrent pas de propriétés tumorales. Pour cela, nous avons réalisé un test classique de tumorigénicité en injectant par voie sous-cutanée à des souris, des kératinocytes et des fibroblastes de patient EBDR génétiquement corrigés avec le rétrovirus SIN COL7A1. Après 9 mois d’observation, nous sommes en mesure d’affirmer que ces cellules génétiquement corrigées n’ont pas de potentiel tumoral détectable, alors que les contrôles positifs réalisés en injectant des cellules HeLa (tumorales) montrent le développement de tumeurs chez la souris. 2. Mise au point de tests pour l’étude de la tolérance immunitaire Un obstacle potentiel dans cette approche thérapeutique serait la réponse immunitaire induite par l’expression d’une protéine codée par le transgène, absente ou anormale chez le patient avant la correction génique. Nous avons donc développé 2 tests, l’un visant à détecter une réponse cellulaire cytotoxique, l’autre une réponse humorale (production d’anticorps) dirigée contre le collagène VII.
a. Développement d’un test ELISPOT pour étudier la réponse cytotoxique in vitro Il s’agit du test in vitro le plus sensible capable de déceler une réponse immunitaire cytotoxique. Nous avons mis ce test au point sur les cellules d’un sujet témoin en mettant les lymphocytes de ce sujet en présence de monocytes (cellules présentatrices d’antigène) et de collagène VII recombinant purifié. Nous n’avons pas mis en évidence d’activation des lymphocytes témoins, alors que l’addition d’un puissant stimulant (concavaline A) induit une forte sécrétion de cytokines. Ceci incite à étudier des patients EBDR exprimant ou pas du collagène VII, et des patiens atteints de la forme acquise des EB (EBA) due à des anticorps circulants anti-collagène VII. b. Détection d’anticorps circulants anti-collagène VII Nous avons développé 2 tests visant à détecter la présence d’anticorps circulants dirigés contre le collagène VII (une méthode par immunofluorescence indirecte et un test ELISA), et avons comparé leur sensibilité. La recherche d’anticorps circulants par étude d’immunofluorescence indirecte utilise des coupes de peau clivées d’un sujet sain mise en présence du sérum du patient, puis incubée avec un second anticorps marqué pour révéler la fixation d’anticorps circulants. Nous avons validé ce test en utilisant le sérum de patients atteints d’EB acquise chez qui nous avons mis en évidence la présence d’anticorps circulants neutralisants. A l’opposé, ce test est resté négatif chez les patients EBDR étudiés. Le test ELISA utilise du collagène VII recombinant purifié, fixé au fond d’une plaque de titration. La présence d’anticorps circulants est détectée à l’aide d’un second anticorps fixant les immunoglobulines humaines. Nous avons validé ce test à l’aide de sera de patients atteints d’EB acquise en mettant en évidence la présence d’anticorps circulants anti-collagène VII. Ce test est maintenant prêt à être utilisé chez des patients EBDR. Au total, ces études immunologiques permettront (1) d'évaluer l'intérêt d'une immuno-suppression ou de l'induction d'un état de tolérance vis-à-vis du collagène VII comme proposé, (2) de mettre au point le suivi immunologique des patients lors de l’essai clinique de phase I/II de thérapie génique ex vivo.
IV - Conclusion et perspectives Les résultats pré-cliniques obtenus ont apporté la preuve de principe de l’approche par thérapie génique ex vivo de l’EBDR. Celle-ci utilise un rétrovirus sécurisé SIN exprimant COL7A1 sous le contrôle du promoteur EF1a. Les tests de tumorigénicité ne montrent pas de potentiel tumoral des cellules génétiquement corrigées. L’ensemble de ces résultats permet de choisir ce vecteur pour un essai clinique. Les tests immunologiques mis au point permettent de tester la tolérance immunitaire des patients EBDR. L’ensemble de ces résultats conduit à préparer un premier essai clinique dans le contexte du projet européen THERAPEUSKIN. La préparation de cet essai clinique de phase I/II de thérapie génique ex vivo comprend les étapes suivantes: - les études toxicologiques chez la souris - l’obtention de désignation de médicament orphelin auprès de l’E.M.E.A. (Agence Européenne du Médicament) - l’établissement d’une lignée productrice et la production de lots cliniques de vecteurs rétroviraux à Généthon selon les normes G.M.P. (Good manufactory Practice) - l’obtention des autorisations auprès de l’ agence réglementaire nationale (A.F.S.S.A.P.S.) - l’élaboration d’un protocole clinique consensuel - la sélection des patients sur des bases cliniques, moléculaires et immunologiques - l’obtention du financement pour l’essai clinique, - l’identification d’un promoteur pour l’essai clinique - la mise au point de tests immunologiques pour le suivi des patients post-greffes. Chacun de ces objectifs sera poursuivi dans l’avenir afin de pouvoir proposer un essai clinique chez l’homme dès que possible.
V - Communications dans des congrès nationaux ou internationaux: Orales: Titeux M, Zanta-Boussif A, Rochat A, Décha A, Tonasso L, Barrandon Y, Danos O and Alain Hovnanian. “Thérapie génique ex vivo des épidermolyses bulleuses dystrophiques récessives utilisant des rétrovirus sécurisés exprimant le collagène VII sous contrôle de son promoteur". 4ème congrès annuel de la Société Francophone de Thérapie Cellulaire et Génique, 28-29 juin 2005, Lyon, France. Titeux M, Zanta-Boussif A, Rochat A, Pendaries V, Décha A, Tonasso L, Barrandon Y, Danos O, Hovnanian A. “Ex Vivo Gene Therapy for Recessive Dystrophic Epidermolysis Bullosa using Safe Retroviral Vectors Expressing Type VII Collagen under the Control of its Promoter”. 35th annual ESDR meeting, 22-24 September 2005, Tübingen, Germany. Titeux M, Zanta-Boussif A, Rochat A, Pendaries V, Décha A, Tonasso T, Barrandon Y, Danos O, Hovnanian A. Recessive dystrophic epidermolysis bullosa functional correction by regulated expression of COL7A1 cDNA using a self inactivating retroviral vector. "3ème Assises de génétique humaine et médicale, Montpellier, France. Janvier 2006. Hovnanian A and Therapeuskin partners. Safe Retroviral Vectors Expressing Type VII Collagen for Ex Vivo Gene Therapy for Recessive Dystrophic Epidermolysis Bullosa. British Society for Gene Therapy, Warwick University, United Kingdom, 20-21st March 2007 Posters: Titeux M, Zanta-Boussif A, Rochat A, Pendaries V, Décha A, Tonasso L, Barrandon Y, Danos O, Hovnanian A. “Ex Vivo Gene Therapy for Recessive Dystrophic Epidermolysis Bullosa using Safe Retroviral Vectors Expressing Type VII Collagen under the Control of its Promoter”. 35th annual ESDR meeting, 22-24 September 2005, Tübingen, Germany. Titeux M, Zanta-Boussif A, Rochat A, Pendaries V, Décha A, Tonasso L, Barrandon Y, Danos O, Hovnanian A. “Recessive dystrophic epidermolysis bullosa functional correction by regulated expression of COL7A1 cDNA using a self inactivating retroviral vector”. 55th ASHG meeting, 25-29 october 2005, Salt-Lake-city, USA
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